敲黑板！！！His標簽融合蛋白純化常見問題和解決方案全收納

His標簽融合蛋白的純化是借助于層析介質上的過渡金屬離子（如Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+等）與His融合蛋白上的His標簽的配位作用實現目標蛋白的分離。組氨酸（His）的殘基上帶有1個咪唑基團，可以和Ni2+等過渡金屬離子形成配位鍵而選擇性的結合在金屬離子上，這些金屬離子通過螯合配體固定在層析介質上，因此帶有His標簽的蛋白可以特異性的吸附在螯合了Ni2+等過渡金屬離子的層析介質上，而其他不含His標簽的雜質蛋白則不能吸附或僅微弱吸附在介質上。通過提高緩沖液中的咪唑濃度進行競爭性洗脫，可以將His標簽融合蛋白從層析介質上解吸附下來，從而得到較高純度的目標蛋白。

常用的His標簽融合蛋白純化的填料有Ni Tanrose 6FF（NTA/IDA）金屬螯合親和填料，但是在使用過程這種常常會出現一些問題，這里就給各位老師介紹下常見問題和解決方案

填料清洗

當填料使用過程中發現反壓過高或者填料上面出現明顯的污染時，需要進行在位清洗操作 （Cleaning-in-Place，CIP）。

建議按照下面操作去除填料上殘留的污染物，如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。

去除強疏水結合的蛋白，脂蛋白和脂類

通過使用 30%異丙醇清洗 5-10 個柱體積，接觸時間為 15-20 分鐘可以去除此類污染物。然后，再使用 10 倍柱體積的去離子水清洗。也可以選擇使用含有去污劑的酸性或堿性溶液， 清洗填料 2 倍柱體積。例如，含有 0.1–0.5% 非離子去污劑的 0.1 M 醋酸溶液，接觸時間 為 1–2 小時。去污劑處理后，需要使用 70%的乙醇清洗 5 個柱體積，以*去除去污劑。后使用 10 倍柱體積的去離子水清洗。

去除離子作用結合的蛋白

使用 1.5M NaCl 溶液接觸時間為 10-15 分鐘清洗。然后，再使用去離子水清洗 10 個柱體 積。

填料再生

組氨酸標簽蛋白親和純化填料所帶的鎳離子不需要經常螯合去除和重新掛鎳離子。當填料使 用過程中發現顏色變淺，或者填料載量明顯變低時，需要進行對填料進行鎳離子剝離和重新 掛鎳離子，也就是填料再生。將填料裝填在合適的層析柱內，按照下面操作流程進行鎳離子 剝離和重新掛鎳離子。

1) 使用 0.2 M 醋酸溶液（含 6 M GuHCl）清洗 2 倍柱體積；

2) 使用去離子水清洗 5 倍柱體積；

3) 使用 2% SDS 清洗 3 倍柱體積；

4) 使用去離子水清洗 5 倍柱體積；

5) 使用乙醇清洗 5 倍柱體積；

6) 使用去離子水清洗 5 倍柱體積；

7) 使用 100 mM EDTA (pH 8.0)清洗 5 倍柱體積；

8) 使用去離子水清洗 5 倍柱體積；

9) 使用 100 mM NiSO4 清洗 5 倍柱體積；

10) 使用去離子水清洗 10 倍柱體積；填料再生后，可以立即使用，也可以保存在 20%的乙醇中，置于 4°C 保存。