液相色譜中分離度變差該怎么辦？

相信很多小伙伴都遇到過這類情況，色譜柱使用一段時間后相鄰色譜峰分離度變差，峰形也變寬，或者在做方法開發時，目標物分離度不好。導致這類情況的原因有哪些？遇到問題后該如何排查？今天就和小伙伴們討論交流一下。

在液相色譜中，分離度R_s是色譜分離之中最重要的部分，不管色譜最終的目的是定量定性分析還是樣品制備，都是在一定的分離度基礎上來實現的。分離度計算公式如下：

其中，R_s表示分離度，t_R2表示相鄰峰中后一個峰的保留時間，t_R1表示相鄰峰中前一個峰的保留時間，W₁和W₂是兩個峰在基線處的峰寬W。

色譜峰的保留時間相差越大，或者峰形越窄，就能得到更好的分離結果（分離度增加）。對于色譜分離來說，基線分離有助于獲得準確的定量分析結果。兩個大小接近的色譜峰，基線分離對應R_s>1.5。

從分離度的計算公式可以看出，造成分離度下降最直觀的原因有：峰形變寬、拖尾或前延，保留時間發生變化。所以，導致分離度降低的主要原因有：

1. 色譜柱使用時間太長，柱效下降了；

2. 色譜柱或者保護柱或者系統有污染；

3. 樣品被污染變質，導致峰形變寬、拖尾或前延，或出現雜峰干擾；

4. 儀器柱外死體積過大（管路太長，管路內徑太大，檢測器流通池體積過大等），導致柱效降低，峰形變寬；

5. 柱溫的影響。

如果是在日常實驗中，碰到分離度降低的情況，首先要排查色譜柱（包括保護柱）是否有污染或者失效，對其進行清洗或更換；其次是要排查樣品污染的問題，重新配制樣品進行分析；最后排查系統污染和流動相污染的問題，清洗儀器管路，更換在線過濾器并更換流動相。排除上述幾種可能性，基本就能解決分離度降低的問題。

如果在方法開發過程中遇到分離度低的情形時，影響因素就有很多了，比如色譜柱類型、填料粒徑、有機相的種類和比例、緩沖鹽的類型和濃度、柱溫、色譜柱的長度等。具體的影響以后會再和大家一一討論。