如何建立一個峰形好、分離度大、靈敏度高的分析方法？

了解樣品的主要性質，是選擇分離模式的關鍵。針對特定的分析物，選擇合適的分離模式，是進行有效色譜分離的首要問題。

色譜柱的選擇是建立液相色譜方法時必須考慮的問題，選對色譜柱往往可以實現(xiàn)事半功倍的效果。常用的色譜柱主要有C18、C8、苯基柱、氰基柱、氨基柱、離子交換柱等。

C18柱是方法篩選時zui常用的色譜柱，對于疏水性較強（LogD＞0）的待分析物往往有很好的保留。C8和C4柱等是保留能力稍弱于C18的經典反相色譜柱。另外，根據(jù)待分析物分子量、流動相中水相比例、pH等的差異，可以選擇不同類型的色譜柱。

苯基柱和五氟苯基柱存在中等強度的疏水相互作用和強π-π相互作用，五氟苯基柱還存在強的偶極作用，對于芳香族化合物，特別是苯環(huán)上的位置異構體，常規(guī)C18無法通過疏水相互作用將其有效分離，苯基柱可以通過它們之間的π-π相互作用差異實現(xiàn)分離。

對于C18上沒有保留的化合物，氰基鍵合相是個很不錯的選擇。氰基鍵合相在正相和反相模式中均可以使用。在反相色譜中，氰基的疏水性相對較弱，且由于具有π-電子作用，適用于C18柱保留較弱的樣品。在正相色譜中，氰基的極性相對更弱，是保留能力最小的正相吸附劑。

氨基柱可用于正相、反相和弱陰離子交換，在反相條件下特別適合分析糖類物質，在正相條件下可用于分析一些溶于烷烴、烯烴和芳香烴的有機化合物，在低pH緩沖液中能分離帶負電荷的分子。

流動相的選擇和比例調整是開發(fā)方法最重要的環(huán)節(jié)，很多時候分離度不好、峰形差的問題都可以通過調整流動相來解決。流動相的選一般遵循由強到弱，先粗調再微調的思路。

由強到弱：即首先選擇強洗脫條件，以快速得到分離結果，然后再根據(jù)出峰情況調整流動相比例。

先粗調再微調：當分離達到一定程度，對流動相的比例、緩沖鹽pH等條件的調整就要做的更加精細，以優(yōu)化得到最佳分離條件。

柱溫對保留時間、柱壓和峰形都有一定的影響。一般來說，升高柱溫，保留時間縮短，柱壓降低。但有時也會出現(xiàn)保留時間隨柱溫升高而延長的情況，特別是用鍵合極性基團的反相柱分離一些極性化合物的時候。

對于一些拖尾較嚴重的化合物，適當升高柱溫，可以有效改善峰形和柱效。對于大分子的分析，尤其是運行流速較高時，適當升高柱溫，可以降低柱壓、改善柱效。在手性分離中，一般則是低柱溫有利于提高分離度。

柱溫對峰面積的影響一般不怎么明顯，只有部分離子化合物在不同溫度下的電離程度不同，吸收波長和吸收強度會隨之發(fā)生變化，從而影響峰面積大小。

一般情況下，溶劑對峰形的影響比較小，但是對于一些峰分叉、拖尾等異常色譜行為，也要考慮到溶劑效應的影響。特別是在溶解樣品的溶劑強度大于該樣品出峰時流動相強度時，容易出現(xiàn)色譜峰的展寬或者分叉（反相色譜中的溶劑強度順序為水＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜四氫呋喃＜丙醇＜二氯甲烷）。

另外，在進樣體積較大或溶劑和流動相兼容性差時，也容易導致峰形問題，甚至是保留時間差異。溶劑和流動相的pH差異有時候會引起化合物電離狀態(tài)的變化，也會引起峰形和保留時間問題。