批次之間重現(xiàn)性不好？解決辦法來這找！

我們今天再帶來一個熱點問題的解決思路——“批次性之間重現(xiàn)性不好的解決問題”！

Q 開發(fā)一個新的HPLC方法，結(jié)果認證后，方法會被轉(zhuǎn)移到QC實驗室，怎么能確保良好的重現(xiàn)性？

如果預期一個方法會被用到很多年，重現(xiàn)性將是色譜柱選擇過程中的一個重要問題，需要確認方法在使用期間，色譜柱一直都在供應，意味著選擇一家大型的愿意長期合作的廠商，選擇一種常見的鍵合相，盡量少選擇特殊或者較少使用的固定相。可以先選擇一直合作的品牌開始，還應該從廠商出獲得更多的色譜柱規(guī)格和批次重現(xiàn)性調(diào)查信息，綜合評判。

Q 色譜柱的批次性重現(xiàn)之間的關系，怎么進行判斷？

以反相填料為例：同一批次的填料生產(chǎn)出不同的色譜柱，保留時間，塔板數(shù)，柱壓，都會有點差異。

保留時間的改變與填料密度和色譜柱的體積成正比，色譜柱體積重現(xiàn)性取決于柱內(nèi)徑，柱內(nèi)徑改變后，保留時間會相應改變，但分離度保持不變，那說明你的方法重現(xiàn)性還是比較好的，在我們制定方法的時候，要正確的規(guī)定方法的洗脫時間表。生產(chǎn)廠家對柱體積改變效應造成的保留時間的改變RSD在3%左右，月旭從硬件上進行控制，將該數(shù)值控制在1%左右。

色譜柱塔板數(shù)的變化也會影響方法，特別是涉及到剛好能基線分離的一對色譜峰時，一般情況下塔板數(shù)的重現(xiàn)性在±10%左右，標準偏差減少至2-3%，但塔板數(shù)是一個平方數(shù)，分離度取決于塔板數(shù)的2次方根，因此塔板數(shù)改變2%意味著峰寬變化只有1%，可以核查一下色譜柱制造商的塔板數(shù)出廠控制數(shù)據(jù)。

任何填料在生產(chǎn)的過程中，柱壓的重現(xiàn)性都比較好。

Q 不同批次之前的重現(xiàn)性問題怎么去看待？

不同批次之間的色譜參數(shù)的重現(xiàn)性問題，那么上面提到的參數(shù)會有所改變，更重要的是不同批次的填料有可能引起分離選擇性的變化，一位置相對保留時間會變化，表現(xiàn)在色譜圖上的相對位置改變，不利于方法的確定。這個問題要避免的，可以從生產(chǎn)商那里收集批次重現(xiàn)性是否穩(wěn)定的信息，一般是檢測填料色譜性能的理化參數(shù)。

在理化參數(shù)中，重要的是填料的比表面積，因為他的改變直接導致保留時間的改變，比表面積的變化范圍在±10%，月旭控制在±5%。

在化學參數(shù)中，鍵合相的便面覆蓋率的改變對保留時間的影響比較大，通常制造商會給出載碳量這個數(shù)值，會有一個詳細的數(shù)值，通常范圍是±10%，月旭控制在±4%以下。

制造商會有一個測試色譜重現(xiàn)性的試劑，采用尿嘧啶、苯酚、4-氯硝基苯、甲苯的混合溶液流動相是75%的有機溶劑水的中性條件，對疏水化合物之間的相對保留時間重現(xiàn)性一般比較好，而對于載碳量的改變不太敏感，較好的批次重現(xiàn)性測試是在測試混合物中加入堿性化合物，經(jīng)過優(yōu)選的堿性化合物（通常選用阿米替林）在優(yōu)化過的條件下，主要和填料上游離硅醇基相互作用，而中性化合物主要和鍵合相相互作用，這樣，堿性和中性化合物之間的相對保留時間是對反相填料批次重現(xiàn)性的嚴格測試。月旭積累了這一類批次重現(xiàn)性的測試數(shù)據(jù)，并控制在一個較小的范圍內(nèi)。

Q 如何確定該款色譜柱對我的實驗有較好的批次重現(xiàn)性？

上面說到的廠家對重現(xiàn)行的控制和要求，是用于選擇色譜柱的起點，終測試是對項目本身的重現(xiàn)性測試，一些生產(chǎn)商會有不同批次的填料色譜柱包來用于具體項目測試，而另外一些生產(chǎn)商會根據(jù)客戶的需求提供類似的不同批次的色譜柱，我們需要的是不同時間鍵合相的相同填料裝填的色譜柱，而不是同一批次填料不同時間裝填的色譜柱，建議使用三個不同批次鍵合的填料裝填的色譜柱來測試方法的重現(xiàn)性，如果測試不受填料變化的影響，那可以相信該方法在幾年內(nèi)都是重現(xiàn)的。

看完這一期的“解決思路”感覺對您有所幫助嗎？如果能夠幫到您那就是我們開心的了。