考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量

考馬斯藍(lán)染色法又稱Bradford法，是Bradford于1976年建立起來(lái)的一種蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定方法。考馬斯亮藍(lán)G-250測(cè)定蛋白質(zhì)含量屬于染料結(jié)合法的一種。在游離狀態(tài)下呈紅色，最大光吸收在488nm；當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌鞍踪|(zhì)-色素結(jié)合物在595nm波長(zhǎng)下有最大光吸收。

分析天平、燒杯、玻璃杯、移液槍、紫外分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀。

①標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液：常用牛血清蛋白（BSA），配制1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

②0.01%考馬斯亮藍(lán)染色液G-250：稱取0.01g考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于95%乙醇中，加85%(m/V)的磷酸10mL，最后用超純水定容至100mL，裝入棕色瓶中保存。（不宜久存，室溫1-2個(gè)月）

紫外分光光度計(jì)測(cè)定

將表格所示溶液加入試管中充分混勻，10min后倒入比色皿，放入紫外分光光度計(jì)于595nm測(cè)定吸光值，1號(hào)管作為空白對(duì)照，以蛋白濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)曲作為定量依據(jù)。

②樣品測(cè)定

取含10-100μL蛋白質(zhì)溶液于小試管中，加水稀釋至0.1mL，然后加入5mL G-250蛋白染色液，充分混勻，10min后倒入比色皿，放入紫外分光光度計(jì)于595nm測(cè)定吸光值，1號(hào)管作為空白對(duì)照，將測(cè)得吸光值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的蛋白質(zhì)含量。

酶標(biāo)儀測(cè)定

將表格所示溶液依次加入酶標(biāo)板中混勻，靜置10min后，放入酶標(biāo)儀中于595nm測(cè)定吸光值，A孔作為空白對(duì)照，以蛋白濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)曲作為定量依據(jù)。

②樣品測(cè)定

取含4-40μL蛋白質(zhì)溶液于酶標(biāo)板中，加水稀釋至40μL，然后加入250μL G-250蛋白染色液，充分混勻，靜置10min后，放入酶標(biāo)儀于595nm測(cè)定吸光值，A孔作為空白對(duì)照，將測(cè)得吸光值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的蛋白質(zhì)含量。

①通常會(huì)將樣品稀釋多個(gè)梯度進(jìn)行測(cè)定，防止樣品測(cè)得吸光值過(guò)高，超出標(biāo)曲導(dǎo)致的含量計(jì)算偏差。

②樣品中若含有去污劑，如TritonX-100、SDS等，會(huì)嚴(yán)重干擾測(cè)定結(jié)果。

③比色反應(yīng)需在1h內(nèi)完成，如果測(cè)定要求很嚴(yán)格，可以在染色液加入后的5-20min內(nèi)測(cè)定吸光值，因?yàn)樵谶@段時(shí)間內(nèi)顏色是zui穩(wěn)定的。

④測(cè)定時(shí)，蛋白-染料復(fù)合物會(huì)有少部分吸附在比色皿杯壁上，測(cè)試完后可用乙醇溶液將比色皿中的殘留物沖洗掉，再用超純水沖洗干凈保存。